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大鳞副泥鳅卵和泥鳅精子杂交受精细胞的观察

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   目前,有关类远缘杂交的受精细胞学研究已见
金鱼 鳊鱼、草鱼 三角鲂、青鱼 三角鲂等。大
鳞副泥鳅和泥鳅是重要的试验材料鱼,目前已应用于
细胞核移植、转基因鱼的研究、鱼类雄核发育的研究
以及细胞融合试验等。本研究通过对大鳞副泥鳅和泥
鳅的受精细胞学探讨,一方面了解2种鱼远缘杂交的
可能性,另一方面为其他相关试验提供理论依据。
1、材料与方法
大鳞副泥鳅、和泥鳅、亲本取自武汉市汤逊湖,
根据2种鱼的典型特征区别种类和雌雄。选择性腺发
育良好的大鳞副泥鳅和泥鳅,用绒毛膜促性腺激素
(HCG)催产,雌鱼剂量为1000IU/尾,雄鱼减半。催产
后,放入20℃的恒温水中,效应时间为10h。待卵成
熟后,挤出所有的卵子,杀雄鱼取得精巢,人工授精
得受精卵。
采用Bouin氏液固定,受精之前对成熟卵子取样
固定,受精至受精后,每隔3min取样固定一批,15min
后,每隔2min取样固定一批,直至受精后37min第1
次卵裂沟出现为止。每次固定的卵粒数为50粒左右,
此阶段温度控制在26℃。
受精卵固定20h后脱水,石蜡包埋,连续切片,
切片厚度7~8 m,苏木精伊红染色,并进行显微摄
影。
2、结果
大鳞副泥鳅和泥鳅的受精细胞过程根据受精卵
发育时间和状态,可分为7个阶段。
⑴受精之前
大鳞副泥鳅未受精的成熟卵子直径为0.65~
0.74mm,呈圆球形,透明淡黄色。这时的卵子极性清
晰可见,植物极多为紫红色的卵黄颗粒所填充,动物
极主要集中了染成蓝紫色的细胞质。在胚盘中央可看
到卵膜上有一明显的凹陷,凹陷中央有一圆孔,这就
是精子入卵的通道~~受精孔,周围没有精子细胞存
在。
⑵精子入卵,卵子被激动(受精至受精后3min)
精子从受精孔进入卵子内。卵黄膜从卵表升起成
为受精膜,围卵腔也由此而产生。在所有的组织切片
中,都只看到一个精子入卵,所以大鳞副泥鳅和泥鳅
杂交也遵循单精受精的规律。
⑶雄性精核的形成(受精后6min和9min)
此时,胚盘较以前更加扩大,精子头部核化,精
子和星光体离开卵表面,并膨胀核化,形成雄性精核。
在卵内,雄核正处于解凝过程,并为星光射线所
簇拥。雌核开始核化并向卵子内部移动,逐渐向雌性
原核发育。
由于切片的原因,本试验未观察到第二极体的排
出。
⑷雌雄原核的接触(受精后12min)
雌雄原核在星光射线的牵引下,相向运动。不
久,雌雄原核非常靠近,最后它们彼此紧密接触,
仅为一条称为接合线的狭缝相隔,即将形成合子核。
⑸雌雄原核的融合(受精后17min)
雌雄原核在胚盘中央融合成一个合子核。中心
粒、星光体已一分为二,呈短棒状位于合子核的两侧,
其连线与卵表面平行,星光体的空间位置决定了第1
次卵裂只能是纵裂。
⑹第1次卵裂(受精后19~37min)
雌雄原核融合不久,便开始进行第1次卵裂。首
先是核分裂,染色体受纺锤丝的牵引而分开,使合子
核处于第1次有丝分裂的前期。在纺锤体的作用下,
染色体均匀地排列在赤道板中央,此时正处于第1次
有丝分裂中期;紧接着,染色体离赤道板而去,向两
极移动,星光射线更为开阔,达有丝分裂后期;最后,
染色体被拉到两极形成两个子核,两核之间的细胞质
似乎也受到纺锤丝的影响而开始分离,形成1条白色
的空隙。在卵表面发生细胞质溢缩,形成肉眼可见的
卵裂沟,完成了第1次有丝分裂。
试验证明,大鳞副泥鳅与泥鳅杂交的受精卵在恒
温箱中孵化后,能够孵化出正常鱼苗。
3、讨论
异种动物杂交后的受精卵每向前发育一步,都是
对精子或卵子的一个考验。有时精子能够入卵,但不
能形成星光,因为异种的中心粒难以诱发细胞质形成
微丝、微管。有的即使产生了星光,但精子头部在异
质的环境中难以实现水合作用,或不能摄入蛋白质而
膨胀核化,这样反由卵核发育而导致单性生殖,银鲫
兴国江鲤的杂交则属于这种类型。在有些动物的杂
交受精中,雌雄原核都能形成并相互融合,但由于两
者细胞分裂周期的差异性,染色体分裂节奏的快慢不
同,造成着丝点和纺锤丝之间的配合失调,最终导致
畸形胚胎,杂种鱼正常者仅仅是由于异种精子的激
动,由卵子单性生殖的结果。因此,这种杂交受精过
程中并无精卵核的结合,亦即没有真正的受精作用。
但这一理论有一定局限性,许多作者都曾报道了远缘
杂交的鱼类,甚至不同种间杂交存在正常雌雄原核结
合的事实,但有些远缘杂交会出现四倍体后代。
本试验中,通过连续石蜡切片,观察到泥鳅精子
能够从大鳞副泥鳅卵子的受精孔进入卵内。精子头部
膨胀核化,发出星光,形成星光体。雌雄原核能够融
合成为合子;合子核能够进行正常的有丝分裂,分裂
中期染色体位于赤道板中央,有丝分裂后期,卵表面
发生细胞质溢缩,形成一条白色空隙,而完成正常的
有丝分裂,这一受精过程与刘思阳研究的草鱼 三角
鲂及吴端生和刘筠研究的红鲫与湘江野鲤杂交结果
相类似。
泥鳅和大鳞副泥鳅为鳅科鱼类中两个不同的属,
其中泥鳅的染色体有2n=100和2n=50两种,据信泥
鳅的核型曾发生过2n=50 2n=100的自然加倍过程,
这两种类型广泛分布于各个地理种群,且不一定有严
格的地理隔离。分布于武汉地区的泥鳅为2n=100类
型,这种天然四倍体泥鳅与2n=48的大鳞副泥鳅杂交
后,其杂交后代染色体为2n=74,表明其后代为杂交
种,并非雌核发育或其它发育类型。因为这两种鱼属
远缘杂交,其后代可能出现性腺发育受阻等现象,有
望通过远缘杂交获得可供养殖的、生长速度快的杂交
泥鳅新品种。
从泥鳅和大鳞副泥鳅的受精细胞学来看,亲缘关
系较近的鱼类杂交其受精生物学过程和卵裂方式类
似于同种鱼类如花链和鲤鱼的受精过程。表明亲缘关
系较近的鱼类杂交可获得具有正常生活能力的后代,
这为鱼类的远缘杂交生产提供了可能。
1、未受精的成熟卵在卵膜凹陷处有一漏斗状的
受精孔( 1000)
2、精子从受精孔进入卵子内( 1000)
3、受精后6min雄核形成( 1000)
4、雄核形成后,为星光射线所簇拥( 400)
5、受精后9min,雌核核化( 1000)
6、受精后12min,雌雄原核彼此接触( 400)
7、受精后17min,雌雄原核融合成合子核( 400)
8、受精后23min,合子核第1次有丝分裂的前期
( 400)
9、受精后25min,合子核进行第1次有丝分裂的
中期。
10、受精后29min和31min,合子核进入第1次
有丝分裂的后期( 200)
11、受精后37min后,第1次卵裂完成( 200)

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