近年来的研究发现，动物体内除了体液和细胞两大免疫系统以外，还存在着另一种古老的免疫机制。一些短的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)通过结合细胞内相应基因的mRNA，阻止该基因的表达，这就是RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象。该技术首先在线虫和果蝇等低等生物中取得突破，随之发展成为基因功能研究的有力工具。由于RNAi机制具有超越疫苗和抗病毒药物的诸多优点，它也给许多疾病的防治提供了新的思路。本文主要就其作用机制和动物病毒性疾病预防的应用研究做一阐述。
1 RNAi的免疫机制
1.1 siRNA／miRNA的形成
生物细胞内广泛存在着天然短链RNA，保护生物机体免于外界病原的侵袭，这种具有免疫作用的RNA被称为microRNAs(miRNAs)或small interferencing RNAs(siRNAs)，它们都是21～23碱基的双链RNA (duble-stranded RNA，dsRNA)。miRNAs是由细胞内非编码基因经过转录、前体切割等一系列机制而形成。初级miRNAs转录子的形成需要一段包括该段序列在内的相应核苷酸链作模板，侵入序列在宿主基因组中留下的遗传信息可能是miRNAs的基因基础。在细胞核内，初级miRNAs转录子被RNaseⅢ家族成员Drosha加工成长度大约70 bp的miRNAs前体，然后由跨膜转运蛋白Exportin-5运出核体，在细胞浆内由 RNaseⅢ家族的另一成员Dicer切割成miRNAs[1]。它们也可以是由人工载体转录的dsRNA或shRNA（short hairpin RNA）加工而成，化学合成siRNAs也是常用的方法之一。siRNAs/miRNAs的3′端有两个核苷酸悬突，这是siRNAs参与基因沉默的标志性结构[2]。
1.2 siRNA/miRNA阻断基因表达的过程
在解旋酶的参与下，siRNA双链解开变成单链，但只有反义链（与靶mRNA碱基序列互补链）参与形成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC的形成机制目前还没有完全清楚，这一过程涉及多种蛋白因子，Argonaute2是目前已知的参与RISC形成的关键蛋白。它包括两个关键结构域——PAZ和PIWI，其中PAZ高度保守，目前只在Argonaute和Dicer中发现。PAZ结构域能够与siRNA中3′端的两个悬突碱基结合，它的折叠区是与siRNAs解离链相结合的部位。虽然PAZ不是Dicer或 RISC的靶mRNA结合位点，却与siRNA特异而高效地参与RNAi密切相关[3]。结合了单链RNA的RISC向靶序列移动，互补到对应的mRNA上并将其降解，这样就阻断了蛋白质的合成途径，从而抑制了相应基因的表达或病毒的复制。解离后的RISC可以被循环利用。值得注意的是， RNAi防御机制并不是万能的，某些病毒能够编码dsRNA结合蛋白(dsRNA-binding proteins，dsRBPs)，阻止RNAi介导的宿主防御，已经证明植物中的异源dsRBPs能有效抑制RNAi作用[4]。人腺病毒能在感染后很快产生RNAi抑制作用，这种抑制是通过阻滞Dicer和RISC的活性来实现的。找到病毒的抗RNAi机制对siRNA的临床应用至关重要。
2 siRNA的设计、载体构建及转染
人工启动RNAi途径必须设计并合成特异而保守的siRNA,或构建出高效的表达载体，找到向细胞内转染的佐剂和适当的给药方法途径。
2.1 siRNA的设计及表达应注意的问题
（1）对dsRNA/shRNA的长度要求。一般认为长度超过30 bp的dsRNA能激活RNA依赖性蛋白激酶(protein kinase RNA-dependent，PKR)，PKR然后激活干扰素的JAK/STAT信号通道,启动干扰素的免疫程序，产生一系列的干扰素效应因子，使真核生物转录起始因子2α（ eIF-2α）磷酸化，导致细胞内蛋白质的翻译被全面抑制[5]。但过短的序列又会影响RNAi特异性。在大多的研究中21 bp～23 bp的siRNA相对特异且不会激活PKR途径，传统上认为这个长度能产生RNAi的最佳效果。然而，研究表明27 bp的shRNA在细胞内的效力是21 bp的10倍～100倍。因为shRNA是Dicer作用的底物，可能是Dicer与RISC协同作用，共同完成了对shRNAs的处理[6]。27 bp的siRNA和shRNA不会激活PKR途径，因此是最适合的长度。
（2）siRNA的序列要求。在病毒基因组中找到一段合适的siRNA序列需要考虑很多因素，除了所选序列必须完全保守外，靶mRNA的二级结构可能对RISC复合物产生空间位阻效应，影响siRNA的干扰活性，在设计时应该尽量避免。脱靶(off-target)是指siRNA所引起的除目的序列以外的其它基因沉默的现象。一个理想siRNA的中心区应该包含与其他RNAs的序列错配，以避免沉默脱靶现象[7]。5′端的焦磷酸盐及AA二核苷酸结构可能是激活PRK信号途径的因素之一，体外试验时应该对dsRNA进行磷酸酶处理，设计相对较长的基因序列，以便于在以后的Dicer处理时能够切除多余的5′端焦磷酸基团。研究表明，siRNA的解链首先发生在热力学上更容易进行的一端，5′端解链时被优先结合进入RISC[8]，所以应该选择5′端富含 AU碱基的序列作为靶序列。
（3）对碱基的取代和修饰的影响。人工合成siRNA时，对其碱基的修饰或取代可能影响到沉默活性。反义链5′端磷酸基是与RISC结合的必要结构，当5′端磷酸基被-OMe或者其他基团取代时，RNAi不能发生，但发生在磷酸基上的取得对siRNAs活性影响不大。反义链3′端的修饰是否会产生影响以所取代基团的性质而异。一些荧光类衍生物、2-乙羟基磷酸（2-hydroxyethylphosphate）等可能会降低siRNA的活性[9]。F取代的siRNAs具有耐RNA酶的特性，在培养细胞内比不加修饰时作用明显，-OMe取代也能产生很高的稳定性[10]。无论是正义链还是反义链，2位氨基的取代都会强烈影响其干扰活性[11]。用硫代二酯键取代siRNAs骨架中的磷酸二酯键能增加对磷酸酶的耐受性，但过度取代可能导致活性丢失及毒性产生[12]。LNA（locked nucleic acid，LNA）是近几年发展起来的核酸化学修饰技术，它通过一个亚甲基桥将核糖的2′氧原子和4′碳原子连接起来。LNA能显著延长siRNA的血清半衰期，提高对靶标亲和性，减少脱靶作用的范围和程度[13]。
（4）表达载体的构建。载体构建也是RNAi技术应用的一个关键。由转染入细胞内的质粒载体所介导的RNAi被称为ddRNAi（DNA-directed RNAi）。原理是首先构建出一个方向相反的双启动子载体，将特异的互补DNA序列克隆在两个RNAseⅢ启动子之间，在受体细胞中产生dsRNA，被细胞内的Dicer分解为siRNA[14]。也可以在单启动子载体中插入一段重复序列，复制出一个shRNA，再经Drosha和Dicer处理，最终产生miRNA。细胞内转录与化学合成的siRNAs相比能持续更长的时期，而在细胞内维持时间太短是siRNA进入临床使用的最大障碍之一。
2.2 向细胞或体内的转染
有报道认为在不使用佐剂的情况下，裸露的siRNA也能产生强烈的病毒抑制作用，而且不会激活IFN信号途径。脂质体对DNA载体的跨膜转运作用已被广泛认同，在siRNA的研究中常作为首选的转染工具。一些碱性氨基酸（如组胺酸和赖氨酸等）聚合物也是有效的siRNA转染佐剂，这些聚合物与脂质体相比具有毒性更小的优点。P=B二酯键比P=0有更强的亲脂性和膜穿透特性。胆固醇和脂肪酸等疏水基团也能够促进siRNA进入到机体组织和细胞，只是在应用时注意摸索适当的剂量，以免激活PKR信号途径[15]。聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI)能够促进siRNA的吸收，还能够促进在细胞内长期高水平的基因表达[16]。经鼻给药安全方便，据报道siRNA分子可以数分钟内通过嗅觉神经和三叉神经通道，到达血脑屏障[17]。也有研究表明，在鼻内给药会增加毒性作用，具体情况有待在试验中总结。
3 RNAi在口蹄疫和流感治疗上的应用
3.1 对口蹄疫的预防
口蹄疫病毒（FMDV）共有7个血清型，各型之间几乎没有交叉免疫性，每一血清型又分为若干个亚型，各个亚型之间仅有部分交叉免疫性，一种疫苗很难对另一种血清型乃至不同亚型的毒株产生保护作用，是口蹄疫免疫失败的主要原因之一。siRNAs只是21 bp～23 bp大小的碱基片断，可以找到各个血清型和亚型共有的保守序列。FMDV的变异通常发生在某一区域，例如在3D聚合酶基因的第1 096～1 280碱基，O/A和亚洲Ⅰ型的同源性可达97%~100%，而且基因的变异通常出现在同一位点[18]。联合使用针对病毒几个基因区域的siRNAs可以更有效和全面地干扰靶mRNA的翻译。Kahana R等[19]利用生物信息学的方法分析了所有已发表的FMDV序列，设计出3个至少22 bp的siRNA片断，它们对所有FMDV都具有100％亲和性。应用实时定量PCR(real-time quantitative PCR)方法检测感染细胞中病毒RNA的总量，表明利用siRNA处理的细胞病毒增殖被抑制。当利用3种siRNA的混合物处理细胞时，对病毒的生长产生100％的抑制作用。Liu M等[20]证实，转染siRNA后12 h内可以使BHK-21细胞系FMDV的效价下降10倍~1 000倍，而且这种抑制作用可以持续到转染后第6天。用高感染复数FMDV接种L基因的siRNA表达盒转染的BHK细胞，24 h后用间接免疫荧光方法检测。结果表明，表达载体极大地抑制了口蹄疫病毒在BHK细胞中的复制，该抑制作用具有序列特异性，并降低了BHK细胞的死亡率[21]。对乳鼠颈部皮下注射表达VP1基因siRNA的质粒载体，可以使其对FMDV的敏感性大大降低[22]。成年小鼠腹腔和静脉注射，可在肝、肾、脾、肺、胰等器官诱导对外源基因表达的广泛特异性抑制[23]。
3.2 对流感病毒的干扰作用
流感病毒（Influenza virus，IV）是另一类血清型众多的A类传染病的病原，它不仅容易通过个别碱基的突变发生抗原漂移，还能由不同毒株重组产生新的亚型。IV可以在一种动物体内变异后再侵入到另一种动物体内，造成种间传播。疫苗接种和抗病毒药物的应用只能提供有限的保护。IV的血凝素和神经氨酸酶免疫原性较好，是传统疫苗的研究热点，但也常因这两个基因的快速变异而造成免疫失败。PA/PB基因、NP基因所编码的蛋白同样是病毒复制所不可或缺的因素，选取NP基因和聚合酶基因(PA/PB)中保守序列设计的siRNA，对鸡胚和细胞系中A型IV都有显著抑制作用。使用这些siRNA处理的感染小鼠，IV感染后肺组织中病毒效价明显降低，并能保护小鼠免于致死量病毒的攻毒[24]。siRNA能保护动物耐过H5/H7等高致病性亚型流感病毒的侵袭。这些结果说明了RNAi是一种控制流感的有效措施。M蛋白参与病毒粒子的装配和病毒进出细胞的质子通道，慢病毒载体（lentivirus vector）能有效地将M1基因的siRNA转染到细胞内，造成M1蛋白在转染细胞内的表达抑制，将其与运载工具一起静脉注射到小鼠体内可以产生良好的RNAi作用[25]。因为呼吸系统是IV侵袭的主要部位，滴鼻是一种比较合适给药途径。以呼吸道合胞体病毒（RSV）和副流感病毒（PIV）的保守区siRNA与转染佐剂混合鼻内滴注小鼠，保护程度与其在细胞培养物中的抗病毒活性相一致，而联合使用两种siRNA抑制两种病毒共同感染时，一种过量的siRNA能够缓解另一种siRNA的病毒抑制活性。说明两种siRNA联合使用能够产生协同作用，但是也应当注意RNAi的竞争作用。
