兔子先适应性喂养1周。每只动物免疫前先于一侧耳缘抽取2 mL 静脉血, 4 ℃ 静置过夜, 取血清作阴性对照。用福氏完全佐剂加GST2EGFP融合抗原[剂量为300 Lg, V(福氏完全佐剂): V(蛋白溶液) = 9: 10]背部皮肤皮内注射免疫动物, 每只新西兰大白兔注射2 ~ 3点, 每点注射200 LL; 第28天用福氏不完全佐剂加融合抗原, 同样剂量免疫新西兰大白兔; 第35天时再次注射; 第49天心脏采血30 mL, 4 ℃ 静置过夜, 取血清。采用结合有GST 的亲和层析珠除去待检血清中的GST抗体, 然后4 e 离心, 取上清。采用交联有GST2EGFP的Sepharose 24B珠纯化抗体, 4 e 翻转孵育2 h, 吸附EGFP多克隆抗体, 4 ℃ 离心, 取沉淀, PBS洗2次, 用2倍柱体积的洗脱液( 0. 1 mol/LTris2HC,l pH = 2. 3)洗脱, 回收的洗脱液以0. 1mol/L硼酸缓冲液( pH= 8. 5)透析过夜, 冻干备用。
兔抗猪IL22 、IL26 多克隆抗体的制备 将上述纯化的蛋白与等体积弗氏完全佐剂混合,充分乳化,于家兔颈部、背部多点皮下注射,剂量为1 mg 免疫原/ 只,间隔15 d ,再将纯化蛋白与等量弗氏不完全佐剂相混,充分乳化进行加强免疫,之后每周加强免疫一次。每周采血用EL ISA 方法检测抗体效价,抗体水平达到要求后颈动脉采血收集血清, - 20 ℃保存备用。
1. 2. 2 抗血清的制备。①选4只2月龄、体重1. 5～2. 0 kg的健康新西兰大白兔,取1只作为阴性对照组,剩余3只为试验组。使刚买回的大白兔静养一段时间,以使其适应食物、气温及新的生活环境。②对1 #、2#大白兔注射BPAH2BSA, 3#大白兔注射DPA2BSA, 4#为阴性对照。③用Bradford法[ 8 ]测定BPAH2BSA及DPA2BSA中的蛋白质含量,并将其配成2 mg/ml的溶液。④将上述溶液与等量完全或不完全弗氏佐剂在旋涡振荡器上乳化,直至将一滴乳剂滴入水中呈现球形而不分散(如出现平展扩散即为未乳化好;乳化过的物质放置一段时间(在保存期内)出现油水分层也是未乳化好的表现)。初次免疫将乳化好的试剂(免疫抗原+完全弗氏佐剂)于大白兔背部多点注射,每只注射1 ml; 30 d后的加强免疫用弗氏不完全佐剂乳化,加强免疫于肌肉注射,剂量与初次免疫相同,每14 d加强免疫1次。第4次免疫7 d后从耳缘静脉采血,采用间接酶联免疫法测定抗血清效价。若效价达不到要求,继续饲养,重复加强免疫,直至获得满意的效价。效价达到要求后,单独用免疫原冲击免疫1次, 5 d后收获抗血清[ 9 ] 。
1. 4. 1 提取免疫血清 将提纯的表达产物与弗氏完全佐剂按1 ∶1 混匀乳化后皮下多点注射BALB /C小鼠,每只小鼠抗原接种剂量为100μg。2 周后取等量抗原与弗氏不完全佐剂进行免疫,以后每隔2周同样抗原剂量皮下注射，用ELISA法检测血清效价, 当达到一定的效价时(1∶12 800)时摘眼球提取免疫血清。
表达产物抗血清的制备
将回收的蛋白与适量的1 × PBS 混合后，取0. 2 mL(约20 μg 的抗原)腹腔注射2 只雌性BALB /c 小鼠(4 ～ 5 周龄)，在免疫小鼠之前，先采集血样，将来可作为阴性血清。每两周免疫一次，第二次免疫后14天采血(小鼠在采血前数小时应予以禁食)。采集血样收集于经灭菌的、不含抗凝剂的离心管中。于4 ℃放置过夜，使之凝固。析出淡黄色抗血清。将抗血清转移至另一管中，血凝块以1500 × g 离心10 min。吸出上清液合并于收集到的抗血清管中。抗血清部分保持于- 70 ℃，部分保持于- 20℃(备用)。
抗血清效价的测定采用酶联免疫吸附测定( enzyme linked immunosorbent assay，ELISA):将抗原稀释于包被缓冲液(0. 1 mol /LNa2CO3，pH 9. 6) 中，终浓度为5 ng /μL，每孔加50 μL。并设立空白对照(只加包被缓冲液)。4℃包被过夜后。用1 × PBST[1 × PBS + (0. 1%)Tween 20]于室温下洗涤3 次，每次5 min。然后每孔加200 μL 封闭液(10%的小牛血清溶于1 ×PBS 中)，4 ℃封闭过夜。1 × PBST 洗涤3 次。加入一抗，血清样品按1∶ 100;1∶ 200 倍比稀释于1 ×PBS 中，每孔100 μL，阴性孔加入100 μL 1∶ 200阴性血清，空白孔加入100 μL 1∶ 100 样品血清。37 ℃孵育2 h。1 × PBST 洗涤3 次。加入酶标二抗，酶标二抗按说明书，1 ∶ 1 000 稀释于1 × PBS中，每孔50 μL，37 ℃，2 h。显色，显色液[5 mgOPD (邻苯二胺);4 μL 30% H2O2;10 mL 底物缓冲液( 0. 2 mol /L Na2HPO4，0. 1 mol /L 柠檬酸钠)]，每孔100 μL，37 ℃，至阴性孔显色时，加入50 μL 2 mol /L H2SO4
终止。酶标仪上判读结果。
1. 2. 3 纯化蛋白多克隆抗体的制备 纯化后的PD2L1蛋白免疫日本大耳白兔, 1 mL蛋白溶液(约500μg) 与等量弗氏完全佐剂, 超声混匀制成乳化抗原, 在兔子脊柱两侧进行多点皮内注射。分别在免疫2、4周后用500μL (约100μg) 蛋白质加等量弗氏不完全佐剂通过超声混匀, 在脊柱两侧皮内注射加强免疫。免疫6 周后, 颈动脉取血, 分离抗血清,EL ISA 法测定其抗体滴度。
1. 2. 2 多克隆抗体的制备 将合成的Apaf21抗原肽2KLH与弗氏完全佐剂混合, 在新西兰兔背部行皮内多点注射, 抗原剂量为每只100 μg/次。2周后以相同方法进行第2次免疫(抗原剂量减半, 弗氏不完全佐剂) , 之后每隔3～4周加强免疫1次, 并于加强免疫后7～10 d采血, 用EL ISA法测定血清中抗体的效价。最后1 次免疫后8 d, 颈动脉插管放血, 分离血清, 置- 20℃保存备用。
1. 2. 1 免疫动物 以全长APE1蛋白为抗原, 采用背部皮下及四肢多点注射免疫新西兰大白兔。免疫程序: 基础免疫前
耳缘静脉取血5 mL 分离血清作为阴性对照。每只用抗原500μg与等体积CFA充分乳化后进行注射, 首次免疫后3 d用等量抗原配以CFA加强免疫, 第28天用等量抗原配以IFA第3次免疫。第3次免疫后7 d , 耳缘静脉取血5 mL分离血清, 用间接EL ISA检测抗血清的效价。效价达1∶64 000时颈动脉插管收集全血, 4℃放置过夜, 4 000 r/min离心收集血清, - 70℃保存。效价达不到要求可再加强免疫1次。
1. 2. 2 特异性亲和纯化抗体 将血清样品用生理盐水按1∶10稀释后加入到Protein A柱中, 以上样缓冲液(0. 1 mol/L磷酸钠, 0. 1 mol/L柠檬酸钠, pH7. 0)流洗至基线, 上样, 洗脱液(0. 1 mol/L磷酸钠, 0. 1 mol/L 柠檬酸钠, pH3. 0) , 收集单峰。收集的纯化产物再经抗原特异性亲和纯化, 先在室温下将APE1蛋白偶联在柱上, 反复上样, 37℃缓慢摇动4 h, 使抗体充分桥联。洗脱缓冲液( 0. 1 mol/L 醋酸, 0. 5 mol/L 氯化钠, pH3～4)洗涤柱子, 洗脱下来的液体迅速加入缓冲液(0. 1 mol/L Tirs2HCl, 0. 5 mol/L NaCl, pH9. 0)中和洗脱液的低pH。收集洗脱液进行SDS2PAGE鉴定, - 20℃保存备用。1. 2. 3 EL ISA 检测抗血清效价 将APE1 抗原稀释至1. 0 mg/L包被酶标板, 每孔100μL, 4℃过夜; 10 g/L的BSA封闭, 37℃ 2 h; 洗涤3次后, 以不同稀释度的抗血清作为一抗, 免疫前兔血清作为阴性对照, 每孔100μL, 37℃孵育1 h;洗涤3次后每孔加入1∶2 000稀释的HRP2羊抗兔IgG 100μL,37℃孵育45 min; 洗涤6次, TMB显色, 用酶标仪测定450 nm的吸光度值(A450 ) 。
1. 2. 4 Myosin Va鼠抗血清的制备 抗原为电泳纯化的His2MyoVaCT融合蛋白(2 g/L) , 免疫BALB /C小鼠。初次免疫用100μg融合蛋白, 与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀后于背部皮下多点注射。初次免疫4周后, 进行第1次加强免疫,用50μg His2MyosinVaCT融合蛋白, 与等体积的不完全弗氏佐剂混匀后于背部皮下多点注射。之后每隔2～3周进行1次加强免疫, 共4次。
高典：用作免疫的动物为日本大耳兔，体重2 kg左右，由武汉病毒所动物饲养中心提供，按以下免疫程序来免疫。500ug纯化的pQE-40-MT-2和pET32a(+)-MT-2重组融合蛋白多点注射兔腘淋巴结和脚掌，每点注射0.2 mL。第一次注射2周后加强免疫2次，各次剂量为上次剂量的二分之一，每次间隔两周。第二次、第三次蛋白溶液背部皮下、脚掌多点注射。在第三次免疫2周后，自颈动脉抽取血液。将兔血37℃放置1h后再在4℃放置过夜，1500×g离心30 min，吸取上层的多抗血清，分装后于-70℃冻存。同时还用pET32a(+)-MT-2重组融合蛋白免疫了5只4周龄的昆明雄性小鼠，每只每周一次皮下注射40ug，6周后眼球取血，小鼠抗体血清的处理方法和兔抗体血清的处理方法相同。
