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黄芪多糖对小鼠脾淋巴细胞蛋白激酶C活性的影响

1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃兰州 730050；2.兰州华陇家禽育种有限公司；?3.兰州医学院第一附属医院；4.甘肃省委医务室）

要：采用反相离子对高效液相色谱法测定脾淋巴细胞蛋白激酶C(PKC)活力，观察黄芪多糖(APS)体外对小鼠脾淋巴细胞蛋白激酶C活性的影响。结果表明：APS(100 μg/ml)能引起小鼠脾淋巴细胞PKC活性明显升高。提示APS的免疫增强作用与升高脾淋巴细胞蛋白激酶活性有关。?

: 黄芪多糖；小鼠；脾淋巴细胞；蛋白激酶C

DNA复制及RNA和蛋白质的合成外，还有固肾降压、保肝抗炎的功能。黄芪多糖(APS)是黄芪〖WTBX〗Astragalus mongholicus Bunge.的主要活性成分，具有免疫促进作用。笔者利用反相离子对高效液相色谱测定技术观察了APS对小鼠脾淋巴细胞蛋白激酶C(PKC)的影响,以探讨其对免疫细胞信号转导的作用。?

1 材料和方法 ?

1.1 仪器? 美国Waters公司800高效液相色谱仪。?

1.2 药品与试剂 ?黄芪多糖(APS)本室提取、精制,为乳白色粉末。由D-葡萄糖、D-半乳糖和L-阿拉伯糖组成的杂多糖，分子量为36 300。用时配制成0.1%的水溶液。RPMI-1 640

Histone、Tris、Diolein、DTT、PMSF、抑肽酶均为Sigma产品；ATP(Japan)； Suc

rose、KH₂PO₄ 、MgCl₂ 、CaCl₂均为国产分析纯；甲醇(光谱纯), IPR-A离子对试剂(四丁基磷酸铵)为天津化学试剂有限公司出品。?

1.3 动物?昆明种小鼠,购自中牧股份有限公司兰州生物药厂动物室,体重18～22 g,雌雄兼有, 8周龄。

1.4 脾淋巴细胞的培养?无菌取小鼠脾脏，捣碎，加Hank，s液研磨，冲洗,收集细胞悬液，离心(2 000 r/min)5 min,弃去上清液,用NH₄Cl-Tris破碎红细胞后,加Hank，s液洗涤二次,直至上清液澄清为止。经台盼蓝染色,细胞活率95% 以上。计数，调整细胞浓度为8×10.5个/ml，接种于多孔培养板中，实验组每孔加入0.1% APS 0.1 ml,对照组以RPMI-1 640完全培养基替代，置5% CO₂培养箱，37 ℃培养24 h。?

1.5PKC活性测定?

1.5.1 PKC的制备将细胞培养板中的细胞悬液移至小试管中，离心(1 500 r/min)10 min,弃去上清液，于沉淀细胞中加入PKC提取液0.5 ml/管。PKC提取液内含:Tris-HCl(pH 7.4)20 mmol/l、DTT 2 mmol/l、EDTA 2 mmol/l、Aprotinin 50 μg/ml、PMSF 1 mmol/l、Sucrose 200 mmol/l，于冰浴下超声粉碎,后离心(3 000 r/min) 5 min，得上清液即为胞浆组分和膜性组分，用于PKC活力测定。?

1.5.2 PKC活性测定用反相离子对高效液相色谱法测定。色谱条件：C 18?柱,流动相:甲醇-磷酸二氢钾(20∶80，内含5 mmol/l IPR-A，pH 7.0),紫外检测波长259 nm，流速0.8 ml/min，柱温：27 ℃，进样量20 μl。于以上所得酶蛋白液加入PKC反应液中,使其总体积为1 ml。PKC反应液内含： Tris-HCl 20 mmol/l,APS 100 μg/ml,DG 10 μg/ml, MgCl₂ 210 mmol/l, CaCl₂21 mmol/l,Histon 1 mg/ml,DTT 1 mmol/l,ATP 1 mmol /l。PKC反应液混匀,30 ℃预热 5 min，再加入酶液起始反应,反应开始后于30 ℃水浴摇床中准确保温10 min，置于沸水浴中1 min终止反应，冷却后离心(2 000 r/min)10 min,除去蛋白沉淀，于上清液中加入 1 ml氯仿-甲醇(2∶1)混合液,振荡1 min,以抽提脂溶性物质,再离心(2 000 r/min)10 min,吸取水层,其中含有ATP、ADP和 AMP。将收集的水相置-20 ℃ 保存待测。?

1.5.3 蛋白质含量测定用紫外分光光度法测定。?

1.5.4 PKC酶活力定义一个酶活力单位相当于每分钟使组蛋白(Histon)磷酸化而消耗1 nmol ATP所需的量。?

1.5.5 ATP标准曲线准确称取ATP标准品,用双蒸馏水配成质量浓度为1 mg/ml的标准储备液,测定时以Tris-HCl(pH 7.4)代替酶液,稀释成不同浓度的标准工作液。以标准品的进样量 x 对峰面积的积分值y进行线性回归,其回归方程为 y =80312+355954 x , r=0.93。?

2 结果 ?

HPLC法测定ATP标准品、样品及对照品的色谱图(见表1)。?

,ATP、ADP和AMP可得到良好的分离。

1 ATP标准品、样品及对照品色谱图(略)?

3 讨论?

3.1 PKC广泛存在于各种组织中,它是一种磷脂依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。PKC激活后使底物蛋白磷酸化而引起特定的生理效应。PKC参与多种激素、神经递质及生长因子的调节过程。组蛋白在PKC反应体系中作为酶促反应的底物，在反应中由ATP提供磷酸,ATP降解为ADP和(或)AMP,其中ATP的消耗量与PKC的活力成正比。基于这一原理,可通过测定反应体系中ATP的消耗量来观察PKC的活力。因此,笔者等观察了APS对小鼠脾淋巴细胞PKC活性影响，以此探讨多糖免疫调节与免疫细胞PKC活性之间的关系。

3.2 黄芪多糖（Asragulus Polysacharin,APS）是黄芪中含量较多、免疫活性较强的一类生物大分子。该多糖能促进人淋巴细胞、小鼠腹腔巨噬细胞和中性粒细胞的活化及反转免疫抑制剂环磷酰胺（CY）对免疫器官和免疫功能的影响。梁华平等的研究表明，APS可升高创伤小鼠的IL－2mRNA和IL－2受体mRNA水平，提示APS可通过促进创伤小鼠淋巴细胞IL－2及IL－2R的基因表达而逆转IL－2、IL－2R的抑制状态的，这为研究APS对免疫细胞的信号转导提供了线索。本研究表明, 黄芪多糖能使小鼠脾淋巴细胞PKC活性明显升高,提示APS的免疫增强作用可能与活化PKC，影响免疫细胞的信息传递有关。

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