鸡肉中喹乙醇、卡巴多及其代谢物的残留检测

 喹乙醇(Olaquindox)和卡巴多(Carbadox)同属于喹嗯啉类化合物，喹嗯啉-2-羧酸(QCA)是该类药物在靶动物体内的代谢物，被定为残留检测的标示物。喹乙醇抗菌效力高，抑制肠道内的有害菌，有利于增加动物对饲料的消化利用能力，从而促进动物生长发育，增加畜禽瘦肉率。卡巴多也是一种高效生长促进剂，对改善饲料转化率和促进畜类生长的效果也较显著。该类药物作为饲料添加剂使用效果较好，但同时也存在着较多问题。喹乙醇在动物体内的残留时间长，蓄积毒性大，而卡巴多具有潜在致突变、致癌作用。食用含有该类药物残留的肉类产品，会对人体造成危害。鉴于喹乙醇和卡巴多的毒性和潜在危害，我国对喹乙醇、卡巴多的使用有严格的限定。本研究旨在建立喹乙醇、卡巴多及其代谢物在鸡肉组织中的残留检测方法。

      1 材料与方法

      1、1 材料

      1、1、1 对照品 喹乙醇对照品和卡巴多对照品，美国Sigma公司产品；QCA对照品，纯度≥97％，美国ALDRICH公司产品。

      1、1、2 药品和试剂 乙腈、甲醇、乙酸乙酯和正己烷均为HPLC级，美国TEDIA公司产品；无水乙酸钠和冰醋酸均为分析纯试剂，国药集团化学试剂有限公司生产。

      1、1、3 仪器 Agilentll00高效液相色谱仪，四元泵，配DAD检测器；色谱柱为AtlantisCl9柱(5，lm，3.9mm×150 mm)，美国Waters公司产品；电子天平，PL2002型，中国上海；冷冻离心机，Sigma 31430，Sigma公司产品；OrganomationAssociates氮吹仪，美国Jnc公司产品；台式分散仪，PT-MR2100型，瑞士产品；真空旋转浓缩仪，瑞士BUCHI公司产品；超纯水器，MILLI-Q，美国MILLI PORECO公司产品；超声波清洗器，250LH型，KUDOS公司；多功能食品粉碎机，HL-2070型；旋涡混合仪，Votexgenie-2型，德国产品。

      1、1、4 鸡肉 组织样品为冻鸡肉，购自宁波大学农贸市场，冷冻保存。

      1、2 方法

      1、2、1 提取液、流动相和标准溶液的配制

      1、2、1、1 提取液的配制 将乙腈与乙酸乙酯按1：1的比例混合，充分振荡混合均匀。

      1、2、1、2 乙酸—乙酸钠缓冲液的配制 称取6.56g无水乙酸钠，加超纯水900 mL，溶解后滴加冰醋酸调节pH值到4.6，定容至1 000 mL，即为0.08mol／L浓度的乙酸—乙酸钠缓冲液。

      1、2、1、3 标准品储备液和工作液的配制 准确称取喹乙醇、卡巴多和QCA对照品适量，喹乙醇和卡巴多用二甲基亚砜溶解，QCA用甲醇溶解(可置于超声波清洗器数分钟促进溶解)，分别定容至一定体积，均配制成浓度为1 mg／mL的标准储备液，4℃冰箱保存，有效期3个月；再分别吸取100 uL储备液，用甲醇稀释，使成浓度为10 ug／mL的标准工作液，于4℃冰箱中保存，有效期1周，隔周需重新配制。

      1、2、2 样品处理 称取5 g绞碎的鸡肉样品于50mL离心管中，加入30mL上述提取液，匀浆5 min，旋涡混匀，5 000r／min离心10 min，将上清液收集到梨形瓶中，再用30 mL提取液重复提取一次，离心后合并到梨形瓶中；旋转蒸发浓缩至2～3 mL，转入15 mL离心管中；梨形瓶中再加人3 mL提取液，振荡洗涤后并人离心管；氮吹仪吹干，加入2mL乙腈，充分振荡，再用15 mL乙腈饱和的正己烷，分3次振荡去脂，收集下层乙腈，氮气吹干，加入1 mL甲醇充分振荡，过0.45 um滤膜，进行HPLC分析。

     1、2、3 HPLC色谱条件 色谱柱见1、1、3项；柱温30℃；进样20uL；样品运行时间为25min；喹乙醇的检测波长为380 nm，卡巴多及QCA的检测波长为320nm；流动相由甲醇、水和乙酸—乙酸纳缓冲液组成，采用梯度洗脱条件，具体设定条件见表1。

表1 测定喹乙醇、卡巴多以及QCA的流动相剃度洗脱条件

时间/min	流速/（mL·min-1）	甲醇/%	水/%	缓冲液/%
0 10 10.10 18 18.10	0.8 0.8 1.2 1.2 0.8	15 15 40 40 15	15 15 10 10 15	70 70 50 50 70

      1、2、4 标准曲线方程、线性范围和最低检测限的确定 首先用单一药物标准工作液确定各药物的出峰时间；然后用3种药物标准工作液配制5种浓度的混合标准液，分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1.01ug／mL，测定各药物各浓度的峰面积。以各药物浓度(Ci)为自变量，各平均峰面积(Ai)为因变量，求出线性回归方程和相关系数，进行线性范围评估，并绘制标准曲线。以信噪比(S／N)=3时可检出的最低药物浓度为最低检测限。

      1、2、5 回收率及精密度测定 空白鸡肉样品中添加混合药物标准溶液，制成各药物浓度分别为0.05、0.1、0.2 ug／g的加药样品，按1、2、2项下方法处理，在1、2、3项条件下做HPLC测定，将峰面积乘以样品处理中的稀释倍数，与相应浓度的标准工作液峰面积比较，计算回收率。各浓度测定4次，在不同时间重复3次，计算各浓度相应峰面积值的x±s及批内和批间变异系数。

      2 结果

      2、1 线性范围及最低检测限 在建立的色谱条件下，喹乙醇、卡巴多和喹嗯啉-2-羧酸在0.05-1.00ug／mL浓度范围内，峰面积(y)与浓度(x)呈良好线性关系，标准曲线图分别见图1、图2和图3，回归方程分别为了y=23.831x+0.858 7(r=0.997 5)，y=74.29x+2.8925(r=0.9979)，y=56.756x+1.433 3(r=0.998 2)。喹乙醇、卡巴多和QCA的最低检测限分别为0.05、0.015和0.025 ug／mL。