2006年夏季，我国南方数省暴发的猪“高热病”，给养猪业带来巨大损失，安徽省也未能幸免。现有的研究结果表明猪“高热病”为多病原混合感染及继发感染引起的，其中猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome vims，PRRSV)是主要病原。安徽农业大学动物传染病实验室进行的流行病学调查结果也证实PRRSV为安徽猪“高热病”的主要病原之一。在此基础上，本试验对临床疑似PRRS的病例进行病毒分离鉴定，旨在为了解安徽地区流行的PRRS毒株的生物学特性，并进一步研制相应疫苗奠定基础。
1材料与方法
1．1病料
采自安徽省部分疑似发生PRRS猪场发病仔猪的肺脏、脾、肾、淋巴结等组织。
1．2毒株、细胞及血清
PRRSV VR-2332参考毒株、Marc-145细胞由浙江农科院惠赠；抗PRRSV猪阳性血清、阴性血清由江苏农科院惠赠；FITC羊抗猪IgG，购自北京博奥生生物技术有限公司。
1．3主要试剂及试剂盒
PRRS RT．PCR检测试剂盒购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；琼脂糖为Sigma公司产品；PRRS抗体检测试剂盒购自美国IDEXX公司；DMEM培养基购自GIBC0公司；犊牛血清购自杭州四季青生物材料有限公司；其他常规试剂均为分析纯。
1．4细胞培养
生长液为含有8％胎牛血清(NCS)、青霉素l00U／mL、链霉素l00仙g／mL的DMEM培养液；维持液为含2％NCS，青、链霉素各100 U／mL的DMEM培养液。Marc-145置于5％的C02培养箱中37℃培养至单层后传代培养。
1．5病料的处理
无菌采集发病仔猪的淋巴结、肺脏、脾脏等组织并剪碎，用不含血清的DMEM液研磨制成5—10倍的乳悬液，反复冻融3次后，经l0 000 r／min离心20min，上清悬液用0．22斗m微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存备用。
1．6病毒的分离
取1 mL上述处理的病料上清液接种长成单层的Marc-145细胞，37℃吸附1 h后倒弃接种液，补加维持液3．5 mL，继续培养3～5 d，将培养物反复冻融3次，冻融液5 000 r／min离心l5 min，取上清液1mL盲传。待出现典型细胞病变(CPE)时收获病毒培养物。在液氮中保存待用；连传8代未出现CPE且PCR检测为阴性者判为阴性。
1．7病毒形态观察
将分离病毒的第15代细胞培养物冻融3次，经4℃5 000 r／min离心30 min收获上清，再经35 000r／min超速离心2 h浓缩病毒，用PBS悬浮病毒，吸取少量悬液加2％的磷钨酸负染1 min，经透射电镜观察病毒形态。
1．8半数细胞感染量的测定(TCID50)
将分离病毒作l0-1～l0-8系列稀释，分别接种于单层的Marc-145细胞96孔培养板，每个稀释度8孔，同时设不接病毒的正常细胞对照，置于5％的C02培养箱中37℃培养，连续观察记录细胞病变7d，结果按Reed—Muench法计算。
1．9 间接免疫荧光试验
将Marc-145细胞接种25 mL细胞培养瓶中，待细胞长成单层后，接种分离病毒，72 h后弃掉培养液，用含有0．01％胰酶的EDTA消化后，用PBS离心洗涤，然后在载玻片上涂片。干燥后用4℃冷丙酮固定20 min，滴加美洲型标准株PRRSV VR-2332阳性血清，置湿盒37℃作用1 h，经PBS洗涤后再滴加1：100稀释的FITC．羊抗猪IgG，置湿盒于37℃作用l h，经PBS洗涤3次，晾干后用甘油PBS封片，置荧光显微镜观察结果。同时设阴性血清、正常细胞作为对照。
1．10动物回归试验
将病毒分离第l5代Marc-145细胞培养物经口鼻途径接种40日龄PRRSV抗体检测阴性健康猪2头，5．0 mL／头，并设2头健康猪接种正常细胞培养物作为阴性对照，隔离饲养，每日测体温，并观察其采食、饮水、精神状况及其他临床表现。每隔3 d，分别采集接种猪和对照猪的血样作RT．PCR检测。
1．11 RT-PCR鉴定
按猪繁殖与呼吸综合征试剂盒说明，提取分离病毒细胞培养物的总RNA，反转录反应条件为：42℃1 h，98 ℃ 5 min，冰浴5 min；PCR反应条件为：94℃预变性5 min；55℃30 S，55 ℃ 30 S，72℃30S，共进行35个循环；最后72℃10 min。取7μLPCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2 结果
2．1病毒分离
将过滤后的病料悬液分别接种于Marc-145细胞，盲传前3代未出现CPE，至第4代开始出现CPE，病变特征为细胞折光性增强、变圆、膨大，部分细胞紧缩呈葡萄串状，随后皱缩，继而灶性脱落，出现大片空洞，与PRRSV典型CPE相符。
2．2电镜观察
将病毒超离产物经负染透视电镜观察，可见典型的以球形或卵圆型为主的具囊膜的病毒粒子，直径大小为50～80 nm，核心直径为20～40 nm。
2．3分离病毒的TCID50测定
按Reed Muench法计算得出分离病毒在Marc-145细胞上的TCID50为l0-4.7／0．1 mL。
2．4 间接免疫荧光试验
用PRRSV VR-2332抗体阳性血清进行间接荧光抗体染色，检测结果发现感染细胞的胞浆内出现黄绿色特异性荧光，而对照组的Marc-145细胞均未见到荧光。
2．5动物回归试验
接毒组的仔猪在接毒2—3 d后，仔猪体温升高至41℃以上，持续高热9～15 d。发病初期临床表现为食欲不振、精神沉郁、呼吸困难、皮肤发红，后期表现为消瘦、四肢无力、喜卧、耳尖发紫等症状。接毒后l5 d病情严重的1头猪死亡，剖检可见腹股沟、肠系膜淋巴结肿大，肺肉样病变，脾脏梗死，表面有点状红色丘疹；另外1头逐渐耐过康复。试验组血清PRRS RT-PCR检测试剂盒检测结果为阳性；对照组2头猪无任何症状，血清试剂盒检测结果为阴性。
2．6 RT-PCR鉴定
对发病猪的组织病料、分离株细胞培养物、攻毒发病仔猪组织病料进行PRRSV的RT—PCR检测，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，均可扩增出约400 bp大小的条带，与阳性对照相符(图3)；阴性对照未见条带。
3讨论
本试验从安徽省部分猪场疑似PRRS发病仔猪的肺脏、脾脏、淋巴结等组织中分离到l株病毒，并进行了一系列鉴定。根据分离毒株致Marc-145的特征性病变、电镜观察、间接免疫荧光试验、动物回归试验、RT．PCR的结果，判定所分离的
